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Qu'est-ce que la microscopie à contraste de phase ?

La microscopie à contraste de phase est un type de microscopie optique dans lequel la différence de phase de la lumière est convertie en contraste pour l'observation.

En microscopie optique ordinaire, les différences entre les spectres de réflexion et d'absorption de la lumière provenant de différentes parties d'un échantillon sont observées comme des différences de luminosité ou de couleur (contraste). Cependant, lors de l'observation de matériaux presque transparents et incolores tels que les cellules vivantes, les micro-organismes et les bactéries, ces contrastes sont pratiquement inexistants et il est impossible d'obtenir des informations telles que la forme.

Même les matériaux transparents et incolores peuvent provoquer une diffraction de la lumière à leurs limites si leur indice de réfraction diffère de celui de leur environnement. La microscopie à contraste de phase utilise la différence de phase entre la lumière diffractée et la lumière traversant directement le matériau pour créer un contraste entre la lumière et l'obscurité, ce qui permet d'observer des matériaux transparents incolores.

Utilisations de la microscopie à contraste de phase

Les microscopes à contraste de phase sont largement utilisés en biologie et en médecine pour l'observation de cellules cultivées et l'examen clinique. L'analyse des bactéries parodontales dans les cliniques dentaires est une application familière pour le grand public. Elle permet de motiver les patients à mieux prendre soin de leur santé bucco-dentaire en leur faisant prendre conscience de l'état de leurs propres bactéries buccales.

La microscopie à contraste de phase permet d'observer des cellules vivantes sans qu'il soit nécessaire de colorer l'échantillon. Lors de l'observation de cellules incolores avec un microscope optique conventionnel, l'échantillon est coloré pour l'observation, mais cette méthode présente l'inconvénient de prendre du temps et de tuer les cellules vivantes.

La microscopie à contraste de phase est également utile pour analyser la substance toxique qu'est l'amiante. Des normes définissent plusieurs méthodes d'analyse de l'amiante. L'une de ces méthodes est la méthode de coloration par dispersion, dans laquelle des cristaux dans la solution d'immersion avec un indice de réfraction spécifique sont irradiés avec une lumière polarisée sous un microscope à contraste de phase, et la couleur produite est utilisée pour déterminer s'il s'agit ou non d'amiante.

Principe de la microscopie à contraste de phase

Dans la microscopie à contraste de phase, une plaque de phase est insérée uniquement à l'endroit où la lumière directe passe entre l'objectif et le plan de l'image pour avancer ou retarder la phase de la lumière directe de 1/4λ. Parallèlement, un filtre ND annulaire est inséré pour réduire l'intensité de la lumière directe, mais ne modifie pas la phase ou la luminosité de la lumière diffractée.

Grâce à ces opérations, la différence de phase entre la lumière directe et la lumière diffractée devient 1/2λ ou 0, et les contrastes clairs et sombres sont créés par interférence.

En d'autres termes, à l'endroit d'un changement soudain de l'indice de réfraction où la lumière diffractée est générée, la lumière directe et la lumière diffractée interfèrent l'une avec l'autre de sorte qu'elles s'affaiblissent mutuellement lorsque la différence de phase est de 1/2λ, ce qui donne un aspect sombre. C'est le contraste sombre. En revanche, lorsque la différence de phase est égale à 0, l'endroit où l'indice de réfraction change brusquement apparaît clair parce que la lumière directe et la lumière diffractée interfèrent l'une avec l'autre d'une manière qui les renforce. Il s'agit du contraste lumineux.

Autres informations sur la microscopie à contraste de phase

1. Problèmes liés à la microscopie optique

En microscopie optique conventionnelle, un matériau peut être identifié par des différences d'intensité (amplitude) ou par des différences de couleur (longueur d'onde), ou par les deux, de la lumière transmise à travers le matériau observé. Par conséquent, il n'est pas facile, par exemple, de reconnaître la différence ou la limite entre une substance transparente incolore A et une substance transparente incolore B en contact avec une substance transparente incolore A, même si elles sont observées à l'aide d'un microscope optique ordinaire.

En effet, il n'y a pas de différence d'intensité et de couleur de la lumière transmise, ni de contraste entre A et B. Cependant, si les indices de réfraction des substances A et B sont différents, la lumière se divise, à la frontière entre les deux, en lumière directe, qui traverse directement l'échantillon, et en lumière diffractée, dont la trajectoire est modifiée. Étant donné que la lumière diffractée est générée là où l'indice de réfraction change brusquement, elle contient des informations sur la forme de la frontière et la structure interne de chaque substance de l'échantillon.

Il est important de noter que la lumière diffractée est retardée d'un quart de longueur d'onde (λ) (1/4λ) par rapport à la lumière directe qui traverse l'échantillon. Un tel retard d'une fraction de longueur d'onde est appelé différence de phase. Même si la lumière diffractée est générée, la différence de phase est infime car elle est faible par rapport à la lumière directe.

Par conséquent, la lumière de l'image résultante, qui est la somme de la lumière directe et de la lumière diffractée, a une forme d'onde similaire à celle de la lumière directe, et aucun contraste entre le clair et l'obscur n'est produit par la microscopie optique ordinaire.

2. Différence entre la microscopie à contraste de phase et la microscopie à interférence différentielle

En plus de la microscopie à contraste de phase, la microscopie à interférence différentielle est un autre type de microscope qui utilise l'interférence lumineuse pour obtenir un contraste. Dans la microscopie à interférence différentielle, la lumière incidente sur l'échantillon est séparée en deux polarisations avec des trajectoires légèrement différentes, et les deux lumières interfèrent l'une avec l'autre après avoir traversé l'objet d'observation pour obtenir un contraste.

Elle est similaire à la microscopie à contraste de phase en ce sens qu'elle permet d'observer des matériaux incolores et transparents impossibles à observer. Cependant, la microscopie à contraste de phase permet d'obtenir un contraste lorsque l'indice de réfraction de l'échantillon change brusquement, alors que la microscopie à interférence différentielle permet d'obtenir un contraste lorsqu'il y a un gradient dans l'épaisseur ou l'indice de réfraction de l'échantillon.